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April 30 凋亡：细胞的绝唱-zz摘要： 近二十年来，随着现代分子生物学技术的应用，细胞凋亡领域取得了飞速的进展，从而让我们能更深入地了解凋亡的分子机制，以及凋亡与疾病的关系。本文将对细胞凋亡领域做一个技术回顾。上篇介绍凋亡的发现史，它与坏死、自噬的关系，以及细胞为什么会凋亡；下篇将重点聚焦细胞凋亡的机制。凋亡检测方法也即将出炉。
凋亡：细胞的绝唱（上篇） 生老病死是大自然的规律。对于每一个细胞而言，它也是注定要死亡的。细胞死亡的方式，目前认为可分为两大类型：细胞坏死（necrosis）和程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）。对于程序性细胞死亡而言，一般又分为两类：凋亡（apoptosis）和自噬（autophagy）。apoptosis这个词源自希腊语，意思是树叶或花瓣的落下。花落叶落都是自然的生理现象，类似地，细胞凋亡是生物体内绝大多数细胞在一定的发育阶段中都会发生的正常现象。它能及时有效地清除体内过量或有潜在危险性的细胞，用于维持体内各种类型细胞数目的平衡。这种平衡对于促进器官形成以及维持机体内环境的稳定都是至关重要的。对于一个8-14岁的儿童来说，平均每天有200-300亿个细胞发生凋亡。在胚胎发育时期，手指和脚趾的形成也是因为指间的细胞凋亡了，我们才有了手指而不是鸭蹼。 凋亡的发现史 早在100多年前，科学家们就发现了细胞凋亡现象。细胞病理学的祖师爷Rudolph Virchow 就观察到细胞死亡的方式有两种，一是细胞坏死 (necrosis)，一是细胞渐进性坏死 (necrobiosis)。然而直到1965年，这个话题才重新热起来。昆士兰大学的病理学家John Kerr 在利用电镜研究组织时，将细胞凋亡与坏死区分开来。后来，Kerr 获邀进入英国阿伯丁大学。1972年，他与Alastair Currie、Andrew Wylie一起，在《英国癌症杂志》上发表了里程碑式的论文，题为“Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.”。他们在亚伯丁大学希腊文教授J. Cormack的建议下，将细胞的自然死亡过程被称为凋亡，与细胞坏死相区别。近二十年来，随着现代分子生物学技术的应用，细胞凋亡领域取得了飞速的进展，从而让我们能更深入地了解凋亡的分子机制，以及凋亡与疾病的关系。2002年的诺贝尔生理或医学奖就授予了在细胞凋亡方面做出突出贡献的三位科学家，分别是：Sydney Brenner、John E. Sulston和Robert Horvitz。 自杀与他杀 如果说程序性细胞死亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自我结束生命的死亡方式，那么细胞坏死则可以看作是他杀。杀手多为高温、缺氧、营养不良及多种物理或化学因素。自杀和他杀当然存在着明显不同的特征，这里主要是指形态学方面。 细胞凋亡会使细胞质、细胞核和细胞膜发生一系列生物化学和物理上的变化。在细胞凋亡早期，细胞膨胀变圆，与邻近细胞的联系断绝并且脱离后皱缩。在细胞质中，内质网肿胀积液形成液泡。在细胞核内，染色质逐渐凝集成新月状，附在核膜周边，嗜碱性增强。最终细胞核裂解为由核膜包裹的碎片。在细胞膜上，细胞结点不再相连，细胞膜变得更活跃进而发生内陷。这些变化都将导致细胞裂解为由细胞膜包裹细胞内容物的凋亡小体。在生理条件下，细胞膜上发生特定的调节作用，可以使吞噬细胞识别并吞噬凋亡小体，但不产生炎症反应。 自噬则是利用溶酶体对细胞自身体内的部分细胞质和细胞器进行一系列降解的过程。它的显著特征是形成大量自体吞噬小泡，内质网弥散和染色体发生中度凝集。自噬过程中的细胞骨架虽然解聚，但并不像凋亡过程那样发生明显的细胞骨架降解。 细胞坏死将导致细胞器如线粒体肿胀，细胞膜破损，大量细胞内容物渗漏，并伴随着周围组织的炎症反应。在一些情况下，细胞凋亡与细胞坏死能被很好地区分开来，但在某些情况下，即使是福尔摩斯，也难以判定细胞究竟是自杀还是他杀，因为濒死的细胞同时具备凋亡和坏死的特征。 细胞为什么要自杀？ 是生存压力大，还是人言可畏？主要有两类原因：一是正常发育的需要，例如前面提到的手指发育。蝌蚪在发育成青蛙时，尾部的细胞就发生凋亡。子宫内膜的定期脱落也正是因为凋亡。二是需要摧毁对生物体有潜在威胁的细胞。在细胞感染病毒时，细胞毒性T淋巴细胞通过诱导凋亡杀死被病毒感染的细胞。当细胞调节的免疫反应减少，效应细胞就必须被清除，以防止它们攻击自身。凋亡机制的缺陷就会带来自身免疫疾病，如红斑狼疮和风湿性关节炎。过量的细胞凋亡也会导致机体失衡，正常生命活动受到破坏，例如在艾滋病病毒的攻击下，不该死亡的T淋巴细胞如CD4阳性细胞大量死亡，从而使人的免疫力下降，引发艾滋病。放疗和化疗也会诱导某些类型的癌细胞凋亡。 细胞凋亡的机制 细胞凋亡的机制很复杂，涉及到多个分子。目前普遍认为有两条主要的凋亡诱导途径：死亡受体介导的凋亡途径或外部途径，线粒体凋亡途径或内部途径。虽然两条凋亡通路的上游事件不同，但是它们最终大都导致caspase的激活。细胞凋亡过程受到严格的调控，在正常细胞中caspase处于非活化的酶原状态，凋亡程序一旦开始，caspase被活化，随后发生级联反应，引发不可逆的凋亡。（生物通 余亮） 凋亡：细胞的绝唱（下篇）
外部途径 外部途径的活化是通过特定的死亡配体（如Fas配体、TNFα和TRAIL）与细胞表面的死亡受体（肿瘤坏死因子超家族成员）的相互作用而介导的。尽管不同死亡受体激活的信号通路存在一些差异，但大致的凋亡信号通路是类似的。死亡配体与受体的结合导致神经酰胺的产生。神经酰胺的释放被认为促进了脂筏的融合，让死亡受体大规模聚集。这种聚集放大了凋亡信号。虽然在某些细胞如淋巴细胞中，不发生受体聚集，也能引发凋亡，但在大多数情况下，信号通路的放大是激活整个凋亡反应所必需的。 配体结合之后，受体的胞内结构域发生了构象变化，暴露出“死亡结构域”，并招募不同的凋亡蛋白。这个形成的蛋白复合物被称为DISC（诱导死亡信号复合物）。最后一个步骤是招募到一种caspase，通常是caspase-8前体，导致caspase-8的激活和凋亡的起始。 TNFα与受体TNFR-1的结合导致受体的三聚化以及胞内死亡结构域的聚集。TNFR-1变构后，招募到一种胞内的接头蛋白TRADD（TNFR-associated death domain）。TRADD随后招募到多种不同的蛋白，如下游的TRAF2（TNF-associated factor 2），并激活NF-kB和JNK通路。TRADD也能与FADD（Fas-associated death domain protein）结合，并通过蛋白间相互作用招募到caspase-8前体，形成DISC。在DISC形成过程中，caspase-8前体自动裂解成有活性的caspase-8，并释放到细胞质中，起始下游的级联反应。FADD参与的凋亡通路被FLIP（Flice-inhibitory protein）所抑制。FLIP是一种缺乏蛋白水解活性的caspase-8同源近似物，通过抑制FADD与caspase-8前体的相互作用从而抑制凋亡。 Fas的配体（FasL或CD95）激活凋亡的途径与TNF类似。配体的结合促进了受体的聚集、DISC的形成以及caspase级联反应的激活。不过，Fas受体的信号通路更简单些。接头蛋白FADD直接与Fas受体的死亡结构域结合，而无需TRADD的参与。Fas受体似乎只在凋亡中发挥作用，而不像TNF受体一样参与其他的信号通路。同样，这个过程也被FLIP所抑制。 在对Fas应答的细胞中，一型细胞（type I），如胸腺细胞，其caspase-8有足够的活性，被Fas活化后导致细胞凋亡，在这类细胞中高表达的Bcl-2不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在二型细胞（type II），如肝细胞中，Fas介导的caspase-8活化不能达到足够的水平，因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途径来放大。活化的caspase-8将胞质中的Bid剪切，形成活性分子tBid（truncated Bid），tBid进入线粒体，导致细胞色素c释放，使凋亡信号放大。 在很多细胞内，TRAIL（TNF-related apoptosis inducing ligand）能与受体DR4或DR5结合，引发快速的凋亡。不过有意思的是还存在一些诱骗受体，与DR4和DR5受体竞争。这些诱骗受体称为DcR1和DcR2。它们都能与TRAIL配体结合，但是不会起始凋亡，因为DcR1没有胞内的结构域，而DcR2的死亡结构域截短了，招募接头蛋白所必需的6个氨基酸中有4个缺失。 NF-kB是凋亡的抑制剂。通常NF-kB与抑制蛋白IkB结合，存在于胞质中。在TNF的诱导下，IkB被磷酸化，随后被泛素降解。而自由的NF-kB二聚体被释放，并转位到细胞核中。NF-kB诱导了一系列基因的表达，如FLIP、cIAP1和cIA2等，而这些表达产物抑制了凋亡。凋亡抑制蛋白XIAP（X-chromosome-linked IAP）也由NF-kB调节，它通过BIR结构域和NH2末端接头抑制了caspase-3和-7，从而抑制凋亡。 内部途径 凋亡内部途径是脊椎动物最普遍的细胞死亡途径，能被多种刺激因素活化，包括生长因子撤退、热休克癌基因激活、DNA损伤剂、活性氧、胞内钙离子过多及其他的细胞应激。这些因素导致线粒体外膜透化，及一些促凋亡蛋白的释放，如凋亡诱导因子（AIF）、细胞色素c、Smac/DIABIO等。细胞色素c从线粒体中释放出来不依赖于线粒体膜表面电位下降和线粒体膜通透性的增加。Smac/DIABIO是凋亡抑制蛋白XIAP的抑制因子。而AIF不依赖caspase途径，同样诱导细胞凋亡。它进入胞浆之后被转运到细胞核中，或许是与核酸内切酶G一起，引发染色质的凝集和高分子量DNA（50 kb）的片断化。 细胞色素c从线粒体中释放出来是凋亡中的大事件。一旦细胞色素c释放到胞浆，它就与凋亡激活因子Apaf-1结合，并进一步招募到caspase-9前体，形成多蛋白复合物，称为凋亡小体（apoptosome）。活化的caspase-9进一步导致下游的caspase-3及caspase-7的活化。 线粒体外膜通透性的增加是由于膜通透性转换孔（PTP）的改变或经Bcl-2家族中促凋亡分子活化。PTP复合物主要由位于线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道（VDAC）、位于线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转位蛋白（ANT）以及线粒体基质中亲环蛋白D（cyclophilin D）组成。胞浆内高水平的钙离子能触发PTP的开放，使得水分子及1.5 kD的溶质分子从胞浆自由扩散到线粒体基质，导致线粒体肿胀及跨膜电位的崩解。线粒体外膜通透性增加的另一种机制就涉及到Bcl-2家族。 Bcl-2蛋白家族分成两派，Bcl-2和Bcl-XL是抗凋亡蛋白，而Bad、Bax及Bid是促凋亡的。细胞对凋亡刺激的敏感性依赖于这两派之间的平衡。当促凋亡蛋白过量时，细胞对凋亡敏感。反之，当抗凋亡蛋白过量时，细胞更倾向于有抗性。线粒体表面过量的Bcl-2促凋亡蛋白被认为是PTP形成的重要因素。 Bcl-2家族中的促凋亡蛋白时常在胞浆中巡逻，它们充当了细胞损伤或应激的感应器。在细胞应激时，它们转位到线粒体表面抗凋亡蛋白的所在点。促和抗凋亡蛋白的相互作用破坏了抗凋亡蛋白的正常功能，导致PTP的形成和其他分子的释放。于是又导致了凋亡小体的形成和caspase级联反应的激活。 Bid还是联系死亡受体和线粒体途径的纽带。Bid通常以无活性的形式存在于细胞质中，被激活后转位到线粒体膜上，与抗凋亡Bcl-2蛋白对抗，促进凋亡。在某些细胞类型中，Bid在死亡受体激活后由caspase-8剪切，形成活性分子tBid。tBid快速结合到膜上，之后tBid与Bax相互作用，导致Bax插入膜中，并寡聚化，膜开始变得有通透性，接下来细胞进入凋亡程序。Bcl-XL可阻止tBid与Bax结合，抑制细胞凋亡。Bid还能由其他酶如颗粒酶B和溶酶体的蛋白酶激活。 凋亡过程的主要执行者 Caspase是凋亡过程的主要执行者之一。它们属于半胱氨酸蛋白酶，在细胞中以无活性的酶原形式存在。在凋亡过程中这些酶原被切割，形成具有活性的酶。凋亡的外部途径会导致caspase-8或caspase-10的激活。这些caspase在级联反应中激活其他的caspase。级联反应最终导致效应caspase如caspase-3和caspase-6的激活。效应caspase负责切割关键的胞内蛋白，如细胞骨架蛋白，导致细胞发生典型的形态学改变。 Caspase-3被认为是最重要的执行者，它由上游的caspase（caspase-8、caspase-9或caspase-10）激活。Caspase-3特异性地激活核酸内切酶CAD（caspase activated DNase）。在增殖细胞中，CAD通常与ICAD（CAD的抑制剂）组成没有活性的复合物。在凋亡过程中，ICAD被caspase-3切割，释放出CAD。随后出现DNA的迅速片断化。 除了死亡受体之外，caspase级联反应的激活还存在其他机制。颗粒酶B（Granzyme B）也能由细胞毒性T淋巴细胞运送至细胞内，并直接激活caspase-3、7、8和10。线粒体也是caspase级联和凋亡的关键调节器。线粒体中释放的细胞色素c能导致caspase-9，继而是caspase-3的激活。这个过程通过凋亡小体的形成来调节。 多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）是最早鉴定出的caspase的底物。PARP通过催化多聚（ADP-核糖）的合成，与DNA链的断裂结合并修饰核蛋白，参与了DNA损伤的修复。caspase-3能切割PARP，从而阻止其修复。核纤层蛋白（Lamin）是维持细胞核形状，并调节染色质与核膜间相互作用的核内蛋白。caspase-6对核纤层蛋白的降解会导致染色质凝聚及核片断化。 尽管我们一直以来都将目光聚焦在凋亡和caspase上，但它们并不能代表一切。在清除有瑕疵或存在潜在威胁的细胞方面，还有其他酶在执行着程序性细胞死亡，包括钙蛋白酶（calpain）、组织蛋白酶（cathepsin）、核酸内切酶及其他蛋白酶。它们在一些细胞器如线粒体、溶酶体和内质网的指导下，独立上阵或通力合作。这些非caspase介导的细胞死亡途径，在caspase途径失败的时候，同样能成为生物体的守护天使，并为癌症治疗带来曙光。（生物通 余亮） 形形色色的凋亡检测
以前，我们只关心细胞是死是活。现在，研究者的兴趣已不再局限于此，大家更关心细胞到底是怎么死的，哪条通路受到了影响，观察到的是凋亡的哪个阶段，甚至如何阻止它。 既然凋亡是一个相当复杂的信号级联，那么我们就有很多机会来评估参与其中的蛋白活性。随着凋亡相关蛋白的不断发现，我们也有了越来越多的检测对象。然而，凋亡和坏死的许多特征相互重叠，即使是福尔摩斯也难以分辨，因此有必要采用两种或更多不同的方法来验证细胞的死亡方式。一种检测早期凋亡事件，而另一种则瞄准晚期事件。多重分析现在也变得越来越普及，它能从同一个样品中获得两组或以上的数据。虽然可供选择的方法很多，但没有一种是放之四海而皆准的，每一种都有优点和缺点。因此，在选择凋亡检测方法时，了解每种分析的优缺点很关键。 了解每个模式系统中细胞死亡的动力学同样很关键。某些蛋白，如caspase，表达的时间很短暂。正在经历凋亡的体外培养细胞，最终也必然会经历坏死。而且凋亡细胞会很快地死亡并消失。凋亡从开始到结束一共才2-3小时。因此，如果分析得太早或太晚，就难免出现假阴性。此外，凋亡可能以很低的频率出现，或只是出现在器官、组织中的特定位点。在这种情况下，快速地通览全局就很有用。总的来说，如果你需要细胞死亡机制的详细信息，那么毒素暴露的时间、待测化合物的浓度以及分析终点的选择就变得很重要。 随着凋亡检测工具的日益丰富，我们能利用显微镜、酶标仪、流式细胞仪和发光检测仪等各种各样的工具来检测各种细胞中的凋亡。检测的参数也是五花八门，有caspase、磷脂酰丝氨酸、线粒体膜电位、DNA片断化、细胞色素c等等，令人目不暇接。一般来说，凋亡检测可分为5大类： 细胞形态学的改变 在正常情况下，活性染料不能进入具有完整细胞膜的细胞，当细胞发生晚期凋亡或坏死时，膜结构被破坏，这些染料就可以进入细胞，故利用活性染料可以评价细胞膜的完整性。任何活细胞/死细胞分析试剂盒，如台盼蓝或碘化丙啶（PI）都能挑出已经凋亡及坏死的细胞。不过，那些正在经历凋亡的细胞还能阻止这些染料进入，因此不会被挑选出。那么，这些分析就要与其他检测凋亡的分析来共同印证。 细胞膜的改变 细胞膜的重排发生在凋亡的早期。在许多凋亡细胞中，这种重排导致磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。这一事件可通过Annexin V的染色来检测。Annexin V是一种Ca 2+依赖的磷脂结合蛋白，在Ca 2+存在的情况下，与PS有很高的亲和力，可与凋亡细胞膜上外翻的PS相结合。荧光（如GFP、FITC）标记的Annexin V一旦与凋亡细胞结合，就可以通过荧光显微镜观察到。这种方法的特点是灵敏，能检测单个凋亡细胞。但是坏死细胞的膜也会被标记上。因此，对于PS阳性的细胞，一定要验证膜的完整性。很多公司都提供了双重染色的试剂盒，来同时评估膜的完整性和PS外翻。但是也有一些例外需要注意。目前已知有些细胞类型在细胞表面组成型表达PS，因此Annexin V染色有可能导致假阳性的结果。 DNA片断化 DNA片断化是凋亡晚期的一个重要特征。普通的琼脂糖凝胶电泳就能检测DNA的片断化。我们可将DNA提取出来，进行电泳。凋亡细胞就会产生阶梯状的电泳条带，间隔大约是180 bp。这种方法简单易行，灵敏度约为1×106个细胞，对于凋亡细胞数量多的实验来说很有用。但换句话说，如果凋亡细胞的数量少，就不推荐使用了。而且并非所有发生凋亡的细胞（如神经细胞、肝细胞、胚胎成纤维细胞）都会检测到DNA ladder。另外，DNA片断化发生在凋亡的晚期，如果你没有检测到DNA片断化，那也不排除细胞正处于凋亡的早期。 目前更为常用的DNA片断化检测方法是TUNEL法。脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）将生物素或荧光标记的dUTP加在DNA片断的3’末端，并通过一定的显色系统使之显示出来。很多公司都提供TUNEL检测试剂盒。这种方法较电泳法来说更为灵敏，荧光显微镜能检测到单个细胞，流式细胞仪也能检测约100个细胞。这种方法也很快，3小时内能完成。但它的费用也比电泳法高不少，而且可能会存在坏死细胞或其它细胞的假阳性。基于这些理由，我们还需要另外一种分析。 Caspase的检测 无论是内部途径，还是外部途径，最终都汇集caspase上，因此caspase成为凋亡检测的大热门。市场上有很多caspase检测试剂盒，来检测多种caspase的活性。我们可以通过荧光标记的底物来检测有活性的caspase，也可以利用荧光标记的caspase抑制剂来标记。你也可以通过免疫组化分析来检测切割的底物如PARP。当然，很多公司也有caspase的抗体。这些方法都能够快速定量凋亡细胞。但是有些方法需要裂解细胞，释放出caspase，这样就不能在组织中定位凋亡事件。此外，另一个缺点是caspase的激活并不是一定表明凋亡的发生。而且，caspase家族成员在底物偏爱性上有着很大的重叠，影响了分析的特异性。 如果你想要评估待测样品与对照之间基因表达的差异，就可以考虑芯片。芯片是一种相对较新的凋亡检测方法，它能够同时描绘出凋亡中多种蛋白的表达差异。我们通过芯片能绘制出编码配体、受体、细胞内调节器及转录因子的基因表达图谱。参与了抗凋亡的基因也能用这种方法评估。 线粒体的分析 线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。目前比较流行的分析方法是染料法。通过阳离子染料在线粒体的聚集来检测线粒体膜电位。常用的染料有JC-1。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，产生绿色荧光。这样就可以很方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。但是，这些染料并不能说明细胞凋亡的机制，应与其他凋亡检测方法如caspase分析共同使用。 在活细胞和固定细胞中，从线粒体中释放的细胞色素c能利用荧光和电子显微镜来分析。不过，细胞色素c一旦释放到细胞质中，就变得不稳定。因此，我们必须使用非凋亡的对照，来确保染色条件能够检测任何细胞色素c。 凋亡检测领域仍在不断发展，将来可能会出现更多更快速的检测方法。但正如本文所强调的，我们必须采用两种或以上的方法来验证细胞的死亡方式，这样，我们的结论才更有说服力。究竟是自杀还是他杀，我们要给细胞一个说法！ April 23 Nature Genetics：系统生物学细胞定向分化的关键调控网络最新一期的Nature Genetics在线版刊登了三篇文章，三个独立的研究团队解决了系统生物学理论中最重要的理论，三文章释放了一系列的数据解答了系统生物学细胞定向分化的关键调控网络。同期Nature配发了评论文章，FANTOM studies networks in cells。
系统生物学研究的最终目的在于解决细胞定向分化的路径，实现这一目标不仅有助人类深入了解整体发育，更有利于人们探索干细胞治疗领域（要实现干细胞治疗目的，首先要掌握干细胞定向分化理论知识和技术）。 这三个独立的研究实验室都属于FANTOM项目的实验室，FANTOM项目旨在深入研究人类基因调控网络。目前全球有100多个实验室参加了这一项目，该项目主要利用RNA测序技术将RNA序列数据与DNA序列数据相比较，鉴定基因转录的起始位点。 本期Nature Genetics上的三篇文章的发布者都属于FANTOM项目实验室，第一个研究小组鉴定出一系列的动物基因转录起始位点，这一研究属于FANTOM4项目，目前已经鉴定了人类，鸡和果蝇的转录起始位点的小RNA，大小在18nt左右。 第二篇文章的研究项目也属于FANTOM4计划，通过全基因组扫描技术鉴定出23000个候选反转录转座子调节序列。功能研究显示，这些反转录转座子的转录调节序列对哺乳动物的转录结果具有重要的影响。 第三篇文章的属于FANTOM4项目，选用人类单核细胞为研究对象，鉴定出人类骨髓性白血病细胞系的转录调控网络。这些研究结果表明，多种转录因子组成复杂的网络，共同调节细胞的生长和分化，没有单个的转录因子唯一的调控因子。（生物谷Bioon.com） 生物谷推荐原始出处： Nature Genetics 19 April 2009 | doi:10.1038/ng.312 Tiny RNAs associated with transcription start sites in animals Ryan J Taft1, Evgeny A Glazov2, Nicole Cloonan1, Cas Simons1, Stuart Stephen1, Geoffrey J Faulkner1, Timo Lassmann3, Alistair R R Forrest3,4, Sean M Grimmond1, Kate Schroder1, Katharine Irvine1, Takahiro Arakawa3, Mari Nakamura3, Atsutaka Kubosaki3, Kengo Hayashida3, Chika Kawazu3, Mitsuyoshi Murata3, Hiromi Nishiyori3, Shiro Fukuda3, Jun Kawai3, Carsten O Daub3, David A Hume1,5, Harukazu Suzuki3, Valerio Orlando6,7, Piero Carninci3, Yoshihide Hayashizaki3 & John S Mattick1 It has been reported that relatively short RNAs of heterogeneous sizes are derived from sequences near the promoters of eukaryotic genes. In conjunction with the FANTOM4 project, we have identified tiny RNAs with a modal length of 18 nt that map within -60 to +120 nt of transcription start sites (TSSs) in human, chicken and Drosophila. These transcription initiation RNAs (tiRNAs) are derived from sequences on the same strand as the TSS and are preferentially associated with G+C-rich promoters. The 5' ends of tiRNAs show peak density 10–30 nt downstream of TSSs, indicating that they are processed. tiRNAs are generally, although not exclusively, associated with highly expressed transcripts and sites of RNA polymerase II binding. We suggest that tiRNAs may be a general feature of transcription in metazoa and possibly all eukaryotes. Nature Genetics 19 April 2009 | doi:10.1038/ng.368 The regulated retrotransposon transcriptome of mammalian cells Geoffrey J Faulkner1, Yasumasa Kimura2, Carsten O Daub2, Shivangi Wani1, Charles Plessy2, Katharine M Irvine3, Kate Schroder3, Nicole Cloonan1, Anita L Steptoe1, Timo Lassmann2, Kazunori Waki2, Nadine Hornig4,5, Takahiro Arakawa2, Hazuki Takahashi2, Jun Kawai2, Alistair R R Forrest2,6, Harukazu Suzuki2, Yoshihide Hayashizaki2, David A Hume7, Valerio Orlando4,5, Sean M Grimmond1 & Piero Carninci2 Although repetitive elements pervade mammalian genomes, their overall contribution to transcriptional activity is poorly defined. Here, as part of the FANTOM4 project, we report that 6–30% of cap-selected mouse and human RNA transcripts initiate within repetitive elements. Analysis of approximately 250,000 retrotransposon-derived transcription start sites shows that the associated transcripts are generally tissue specific, coincide with gene-dense regions and form pronounced clusters when aligned to full-length retrotransposon sequences. Retrotransposons located immediately 5' of protein-coding loci frequently function as alternative promoters and/or express noncoding RNAs. More than a quarter of RefSeqs possess a retrotransposon in their 3' UTR, with strong evidence for the reduced expression of these transcripts relative to retrotransposon-free transcripts. Finally, a genome-wide screen identifies 23,000 candidate regulatory regions derived from retrotransposons, in addition to more than 2,000 examples of bidirectional transcription. We conclude that retrotransposon transcription has a key influence upon the transcriptional output of the mammalian genome. Nature Genetics 19 April 2009 | doi:10.1038/ng.375 The transcriptional network that controls growth arrest and differentiation in a human myeloid leukemia cell line The FANTOM Consortium, Riken Omics Science Center1 & Using deep sequencing (deepCAGE), the FANTOM4 study measured the genome-wide dynamics of transcription-start-site usage in the human monocytic cell line THP-1 throughout a time course of growth arrest and differentiation. Modeling the expression dynamics in terms of predicted cis-regulatory sites, we identified the key transcription regulators, their time-dependent activities and target genes. Systematic siRNA knockdown of 52 transcription factors confirmed the roles of individual factors in the regulatory network. Our results indicate that cellular states are constrained by complex networks involving both positive and negative regulatory interactions among substantial numbers of transcription factors and that no single transcription factor is both necessary and sufficient to drive the differentiation process. |
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